등록번호

안내서-0748-02

화장품 광독성 동물대체시험법
(In vitro 3T3 NRU 시험법) 가이드라인

(민원인 안내서)

2018.  6. 26.

지침서ㆍ안내서 제ㆍ개정 점검표
명칭	화장품 광독성 동물대체시험법(In vitro 3T3 NRU 시험법) 가이드라인(민원인 안내서)
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상기 사항에 대하여 확인하였음.
2018년 6월 26일
			담당자 확 인(부서장)		고 경 육 박 기 숙

이 안내서는 화장품 광독성 동물대체시험법(In vitro 3T3 NRU 시험법) 가이드라인에 대하여 알기 쉽게 설명하거나 식품의약품안전처의 입장을 기술한 것입니다.

본 안내서는 대외적으로 법적 효력을 가지는 것이 아니므로 본문의 기술방식(‘∼하여야 한다’ 등)에도 불구하고 민원인 여러분께서 반드시 준수하셔야 하는 사항이 아님을 알려드립니다. 또한, 본 안내서는 2018년 6월 현재의 과학적ㆍ기술적 사실 및 유효한 법규를 토대로 작성되었으므로 이후 최신 개정 법규 내용 및 구체적인 사실관계 등에 따라 달리 적용될 수 있음을 알려드립니다.

※ “민원인 안내서”란 대내외적으로 법령 또는 고시ㆍ훈령ㆍ예규 등을 알기 쉽게 풀어서 설명하거나 특정한 사안에 대하여 식품의약품안전처의 입장을 기술하는 것(식품의약품안전처 지침서등의 관리에 관한 규정 제2조)

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독성평가연구부 특수독성과에 문의하시기 바랍니다.

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팩스번호: 043-719-5150

제·개정 이력

연번	제·개정번호	승인일자	주요내용
1	B1-2007-4-002	2007.11.	화장품 독성시험 동물대체시험법 가이드라인(I) 제정
2	안내서-0748-01	-	「식약처 지침서등의 관리에 관한 규정」 개정에 따른 일괄 재분류 (규제개혁담당관실-3761호, 2017.5.16)
3	안내서-0748-02	2018.06.	제목을 “ 화장품 광독성 동물대체시험법(In vitro 3T3 NRU 시험법) 가이드라인”으로 수정, 내용 정비 및 OECD 가이드라인 영문본을 추가하여 개정

Ⅰ. 개요	6

Ⅱ. 시험원리	6

Ⅲ. 제한점 및 고려사항	7

Ⅳ. 시험방법	7

Ⅴ. 인정요건	10

Ⅵ. 시험결과 및 보고	10

- 별첨 1 : 번역본

- 별첨 2 : 원문

목  차

화장품 광독성 동물대체시험법(In vitro 3T3 NRU 시험법) 가이드라인

Ⅰ. 개요

본 시험법은 광조사에 의해 Balb/c 3T3 세포의 생존율 변화를 neutral red로 측정하여 화학물질에 의해 유도되는 광독성을 평가하는 생체외 광독성 시험(In vitro 3T3 NRU 광독성시험법) 방법이다.

Neutral red : 비확산방법으로 세포막을 통과하여 라이소좀 안에 축적되는 양이온성 염색시약

Balb/c 3T3 세포에 시험물질을 8가지 농도로 처리한 후, 광을 조사한 조건과 조사하지 않은 조건에서 neutral red 흡수 시험으로 세포생존율(IC50)을 비교하여 광독성의 가능성을 예측한다.

IC50 : 음성대조군과 비교하여 세포생존율이 50%로 감소되는 농도

시험 방법은 용량설정시험과 본시험으로 나뉜다. 용량설정시험은 시험물질의 농도범위를 설정하기 위해 수행하고, 본시험은 광독성 유무를 확인하기 위해 수행한다. PIF (photo irritation factor) 값과 MPE (mean photo effect) 값을 이용하여 광독성 유무를 판정한다.

PIF (광자극지수) : 시험물질 처리 후 자외선 조사유무에 따른 IC50 값을 비교하여 생성된 지수

MPE (평균 광효과) : 시험물질 처리 후 자외선 조사유무에 따른 농도 반응곡선을 계산하여 얻은 값

본 시험법을 이용하고자하는 실험실은 가이드라인(별첨 1의 표 1)에서 제시된 참고물질을 모두 잘 구분하는지 확인해야 한다.

Ⅱ. 시험원리

본 시험법은	세포독성을 나타내지 않는 수준의 광에 노출되었을 때와 노출되지 않았을 때의 시험물질에 의한 세포독성을 비교하는 방법이다. 세포독성은 시험물질 처리 24시간 후에 neutral red의 세포내 축적 정도를 측정하여 평가하며, 광을 조사한 조건과 조사하지 않은 조건에서 얻어진 IC50 값을 비교하여 광독성의 가능성을 예측한다.

Ⅲ. 제한점 및 고려사항

광반응이 일어나기 위해서는 충분한 광에너지를 흡수해야 한다. 따라서 광독성시험을 실시하기 전에 시험물질의 자외-가시부 흡수스펙트럼(UV/vis absorption spectrum)을 측정해야 하고, 시험물질의 몰 흡광계수(molar extinction/absorption coefficient)가 10 L × mol-1 × cm-1 이하이면 광반응을 일으킬 가능성이 없어 광독성평가를 위한 본 시험법 또는 다른 생물학적 시험을 수행할 필요가 없다.

본 시험법은 화학물질과 광의 복합작용으로 나타날 수 있는 광유전독성, 광알레르기, 광발암성과 같은 부작용 예측이나 광독성의 정도를 평가할 수 없고, 광독성의 간접적 기전, 시험물질 대사산물 및 혼합물의 영향 등을 보기 위하여 디자인된 시험법은 아니다.

시험물질이 대사적 변환이 일어나 광독성 물질로 작용하는 예는 매우 드물어 본 시험법을 수행할 때에는 대사 활성계의 필요성이 고려되지 않는다.

최고농도에서만 광독성이 나타나면(특히 화학물질이 수용성인 경우), 위험성 평가를 위해 피부 흡수 및 축적, 기타 시험자료(예: in vitro 동물피부나 인체피부시험, 피부모델) 등을 고려할 필요가 있다.

만약 시험물질이 광노출여부와 관계없이 독성이 나타나지 않고, 용해도가 낮아 농도설정이 어려운 경우 본 시험 적용보다는 다른 시험법을 고려해야 한다.

Ⅳ. 시험방법

4.1 세포배양

Balb/c 3T3 세포는 10% NBCS (new-born calf serum), 4 mM 글루타민, 페니실린(100 IU) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL) 등이 포함된 DMEM 세포배양배지를 사용하며, 37℃ 5~7.5% CO2 조건에서 배양한다. 세포의 UVA에 대한 민감도는 계대수와 관련되어 있으므로, 100 이하의 낮은 계대수의 세포를 사용해야 한다. 세포는 96-well 플레이트에 1 × 104 cells/well의 밀도로 배지에 분주하여 각 well 바닥면적의 반 정도를 채우도록 한다. 시험 물질 1개당 2개의 96-well 플레이트에 동일한 조건으로 세포를 배양하여 1개의 플레이트에는 UV를 조사하고(+Irr) 다른 1개는 UV를 조사하지 않으며(-Irr), 시험과정은 동시에 동일하게 진행한다.

시험에 사용하는 세포에 대해서는 UV 조사량에 따른 민감도를 정기적으로 점검하며, 점검 시에는 본 시험법에서 사용되는 광량보다 높은 용량이 포함된 여러 광량이 사용되어야 한다. 세포독성이 없는 최대 광량(예 : 검증시험 시 UVA 영역에서 5 J/cm2)은 본 가이드라인(별첨 1의 표 1)에서 제시된 참고물질들을 구별하는데 충분한 양이어야 한다.

4.2 UV 조사조건

4.2.1. 광원 선택

광원은 시험물질이 흡수하는 파장대(흡수스펙트럼)의 빛을 방출해야 하며, 잘 알려진 광독성 물질들을 검출하기에 충분한 광량이어야 한다. 또한 적외선 영역의 열 방출 등 사용 파장과 광량이 시험계에 부적절한 영향을 주어서는 안 된다. 인공태양광조사기(solar simulator)를 사용하는 것이 적절한 인공광원으로 고려된다. 세포독성이 강한 UVB를 감쇠시키는 필터를 장착해야 하며, 필터를 장착한 인공태양광조사기의 광도 분포는 한낮의 야외 광도 분포와 유사해야 한다. 플라스틱 재료들이 UV 안정화제를 포함하기 때문에 시험에 사용하는 96-well 플레이트 뚜껑을 통과하는 스펙트럼을 측정해야 한다.

4.2.2. 광량 측정

광세기는 적절한 UV 측정기를 사용하여 광독성시험 전에 정기적으로 점검해야 하고 시험에 사용하는 96-well 플레이트 뚜껑을 통과하는 광세기를 측정한다. UVA 영역에서 5 J/cm2의 광량은 Balb/c 3T3 세포에 대해 독성이 없으면서 화학물질을 활성화 시켜 광독성 반응을 일으키기에 충분한 것으로 알려져 있다. 만약 다른 세포주와 다른 광원을 사용하는 경우, 세포에는 무해하면서 광독성 참고물질을 활성화시키기에 충분하도록 조사량을 보정한다.

4.3 시험물질 및 대조물질 조제

시험물질은 안정성 입증 자료가 없는 경우 사용 직전에 준비한다. 시험물질 취급과 처리는 시험물질이 광활성화 되거나 분해되지 않는 조명하에서 수행하도록 한다. UV 조사 중 간섭을 피하기 위해 단백질 성분이나 광흡수성분(예 : pH 지시약, 비타민) 등이 없는 완충액(예 : EBSS)에 시험물질을 녹이고, CO2 배양기 밖에 50분간 방치하기 때문에 알칼리화가 되지 않도록 주의한다. 시험물질의 농도는 침전물이 생기거나 혼탁해지지 않는 범위로 선택한다. 물에 잘 녹지 않는 시험물질은 적절한 용매를 사용하고, 모든 농도의 시험군과 용매대조군에서 같은 용량이어야 하며, 그 농도에서 세포독성이 없어야 한다. 용매로는 DMSO (dimethylsulphoxide)와 에탄올(EtOH) 등이 권장 되고 시험물질의 안정성에 영향을 주지 않는 경우, 용해시키는데 와류혼합, 초음파 처리, 가온을 이용할 수 있다. 매 시험마다 chlorpromazine (CPZ)같은 이미 알려진 광독성 물질을 양성대조물질로 하여 표준작업순서에 따라 동시에 시험해야 한다.

UV 조사(+Irr) 및 UV 비조사(-Irr) 시 시험물질의 농도범위는 용량설정시험을 통해 결정하며, 시험물질의 처리시작과 60분 후(또는 계획된 처리 시간)에 시험물질의 용해도를 평가해 보는 것이 좋다. 또한 부적절한 조건을 피하기 위해 세포배양 시 pH는 6.5-7.8 범위 내에 있어야 한다. 어떠한 시험농도에서도 시험물질이 침전되는 것은 피해야 하고 시험물질의 최대농도는 1000 μg/mL 그리고 삼투압몰농도는 10 mmol을 초과해서는 안 된다. 일정한 희석비율로 8개의 시험물질 농도를 정하며, 관련된 세포독성 정보가 있다면 UV 조사 시의 농도범위를 UV 비조사 시의 농도범위와 다르게 할 수 있다.

4.4 시험물질 및 대조물질의 적용

시험 1일째에 배지 100 μL를 96-well 플레이트 외곽 well에 첨가하여 공시료(blank)를 만들고, 나머지 well에는 1 × 104 cells/well의 밀도로 세포를 분주한다. 용매대조물질, 양성대조물질, 시험물질에 대해 2개의 플레이트(UV 조사 및 비조사)를 준비하고, 24시간 동안 배양하여 세포가 각 well 바닥면적의 반 정도를 채우도록 한다. 24시간 배양 후 각 well을 완충액으로 세척한 뒤, 시험물질 또는 용매대조군 100 μL를 각 well에 첨가하여 CO2 배양기에서 60분간 배양한다. 배양 후, 플레이트 하나는 어두운 곳에 50분 동안 방치하고, 다른 플레이트는 실온에서 50분 동안 UV를 조사하되, 물질 특성 등을 고려하여 시간당 광조사량은 조절가능하며 Balb/c 3T3 세포의 경우 광조사량은 5 J/cm2이 되어야 한다. UV는 플레이트 뚜껑을 덮은 채로 조사하고, 이후 완충액으로 두 번 세척한 뒤 배지를 첨가하고 18~22 시간 동안 배양한다.

4.5 세포생존율 측정

배양이 끝나면 위상차 현미경을 사용하여 세포의 성장, 형태 변화, 단층배양 정도를 기록하고 neutral red 흡수 시험을 실시한다. 가온한 완충액으로 세포를 세척하고, 세척한 완충액을 조심히 제거한 후 neutral red (50 ug/mL) 배지 100 μL를 첨가하여 CO2 배양기에서 3시간 동안 배양한다. Neutral red 배지를 제거한 다음, 완충액으로 세척한 뒤 neutral red 추출액 150 μL(물:에탄올:아세트산 = 49:50:1)를 각 well에 첨가하고 마이크로타이터 플레이트 교반기로 10분 동안 천천히 교반시킨다. 분광광도계 540 nm에서 neutral red 용출액의 흡광도를 측정한다.

혈청을 함유하지 않은 배지에 neutral red를 50 μg/mL로 녹임

Ⅴ. 인정요건

다음의 인정요건을 충족하여야 한다.

5.1 UV 조사 시 음성대조군 및 용매대조군의 세포 생존율은 UV 비조사 시 세포 생존율대비 80% 이상이어야 한다.

5.2 용매대조군에서 얻어진 neutral red의 절대 흡광도(OD540 NRU)값은 세포가 2일 동안 정상적으로 성장했음을 보여주는 지표로, ≥ 0.4 이어야 한다.

5.3 양성대조물질(CPZ)의 경우, UV 조사조건에서 IC50 = 0.1-2.0 μg/mL, UV 비조사조건에서 IC50 = 7.0-90.0 μg/mL, PIF > 6이어야 한다.

처리 농도의 예: CPZ 125∼0.0571 μg/mL, DF (희석계수) 3, [Lee et. al., (2010) The Optimization of Chloropromazine (CPZ) Treatment Condition for in vitro Phototoxicity Test, Journal of Alternatives to Animal Experiments 4(2): 15-21]

Ⅵ. 시험결과 및 보고

PIF (photo irritation factor)값 또는 MPE (mean photo effect)값을 계산하여 시험결과를 평가한다. PIF는 다음과 같은 수식을 이용하여 계산하며, 비조사조건 또는 조사조건에서 IC50를 계산할 수 없다면, 시험물질에 대한 PIF값은 결정할 수 없다.

PIF =	IC50(-Irr, UV 비조사조건)
	IC50(+Irr, UV 조사조건)

MPE값은 다음과 같은 수식으로 계산하며, 농도 반응 곡선의 차이를 기초하여, n개 PE값의 가중평균으로 정의된다(세부 용어 설명은 별첨 1의 Ⅴ-나항 참조).

MPE = [eqn: {sum _{rmi`=1} ^{rmn} rmw _{i`} rm`PE _{c` _{rm`i}}} over {sum _{rmi`=1} ^{rmn} rmw _{i}}]

PIF값 및 MPE값은 OECD 홈페이지에서 제공되는 소프트웨어(Phototox 2.0, ZEBET)를 사용하여 계산할 수 있다. PIF 값으로 5 초과 또는 MPE 값이 0.15 초과인 경우 광독성 양성으로 판정한다.

판정	PIF값	MPE값
광독성 없음	PIF < 2	MPE < 0.1
광독성 가능성 있음	2 < PIF < 5	0.1 < MPE < 0.15
광독성 있음	PIF > 5	MPE > 0.15

명백한 양성 또는 음성 결과를 나타내는 경우 1회 이상 용량설정시험을 포함하는 1회의 본시험만으로 충분하며, 모호하거나 불명확한 결과들은 농도범위, 농도간격, 사전 배양시간, 광조사 시간 등의 실험 조건 변경을 고려하여 추가 실험을 통해 명확히 한다.

시험자료를 이용하여 농도반응 분석과 가능하면 시험물질의 IC50값을 분석할 수 있어야 한다.

시험보고서는 시험물질, 용매 및 세포에 대한 특징과 시험조건 및 절차를 제시해야 하며, 시험물질 각각의 농도와 용매대조군에서의 세포생존율을 평균값으로 표시하고, 광조사 유무에 따른 농도 반응 곡선(시험물질 농도에 따른 상대 세포 생존율)을 나타내야 한다.

별첨 1. 번역본(OECD TG 432)

체외 3T3 NRU 광독성시험법

In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test

I. 서론

1. 광독성은 화학물질을 인체의 전신 또는 국소에 적용한 후 빛에 노출되어 유도되거나 증가되는 독성반응을 말한다.

2. In vitro 3T3 NRU (Neutral Red Uptake) 광독성시험은 빛에 노출 후 여기상태의 화학물질에 의해 유도되는 광독성을 평가하는 것이다. 본 시험법은 빛의 유무에 따라 화학물질에 노출된 세포의 생존율 변화를 측정함으로써 광 세포독성을 평가하는 것이다. 본 시험법에 의해 확인된 물질들은 in vivo에서 전신투여를 통해 피부에 분포되거나 국소적용 되었을 때 광독성을 일으킬 가능성이 있다.

3. 용어 정의는 부록1에 기술되어 있다.

Ⅱ. 초기 고려사항

4. 많은 화학물질이 광독성을 유발하는 것으로 보고되고 있다(1)(2)(3)(4). 이들의 일반적인 특징은 태양광 내의 빛에너지를 흡수한다는 것이다. 광화학 제1 법칙(Grotthaus-Draper 법칙)에 따르면, 광반응이 일어나기 위해서는 충분한 빛에너지를 흡수해야 한다. 따라서 광독성시험을 실시하기 전에 화학물질의 자외/가시부 흡수스펙트럼(UV/vis absorption spectrum)을 결정한다. 만약 화학물질의 몰 흡광계수(molar extinction/absorption coefficient)가 10 L × mol-1 × cm-1 이하면 그 화학물질은 광반응을 일으킬 가능성이 없어 광독성평가를 위한 in vitro 3T3 NRU 광독성시험이나 다른 생물학적시험을 할 필요가 없다(1)(5)(부록 2).

5. In vitro 3T3 NRU 광독성시험은 in vivo 급성 광독성시험 결과를 예측할 수 있음이 밝혀졌다(6)(7)(8)(9). 그러나 본 시험법은 화학물질과 빛의 복합 작용으로 나타날 수 있는 광유전독성, 광알레르기, 광발암성과 같은 부작용 예측이나 광독성의 정도를 평가하도록 디자인된 시험법은 아니다. 또한 본 시험법은 광독성의 간접적 기전, 시험물질 대사산물 및 혼합물의 영향 등을 보기 위하여 디자인된 시험법은 아니다.

6. 유전독성과 발암성을 예측하기 위한 모든 in vitro 시험에서는 대사 활성계를 이용하는 것이 일반적이다. 하지만 아직까지 광독성의 경우에는 화학물질이 in vitro 또는 in vivo에서 대사적 변환이 일어나 광독성 물질로 작용하는 예는 매우 드물어 본 시험을 수행할 때에는 과학적으로 대사 활성계의 필요성이 고려되지 않는다.

Ⅲ. 시험원리

7. 본 시험법의 기본 원리는 세포독성을 나타내지 않는 수준의 빛에 노출되었을 때와 노출되지 않았을 때의 화학물질에 의한 세포독성을 비교하는 것이다. 세포독성은 화학물질 처리 24시간 후 염색시약인 neutral red 흡수의 감소 정도를 측정하여 평가한다(10). Neutral red는 비확산에 의해 세포막을 통과하여 라이소좀 안에 축적되는 양이온성 염색시약이다. 민감한 라이소좀 막의 변화로 라이소좀이 약하게 되고 비가역적인 다른 변화들이 유도된다. 생체이물질 활성에 의해 유도된 변화는 결과적으로 neutral red의 흡수와 결합을 감소시켜 살아있는 세포와 손상된 세포(죽은 세포)를 구별할 수 있게 한다.

8. Balb/c 3T3 세포를 96-well 플레이트(plate) 2개에 단층배양(monolayer)하고, 시험물질을 8가지 농도로 1시간 동안 전처리한다. 2개의 플레이트 중 1개는 세포독성을 일으키지 않는 최대 용량의 자외선을 조사하고, 다른 플레이트는 어두운 곳에 둔다. 새로운 배지로 교환하고 24시간 동안 배양한 후 neutral red 흡수 정도로 세포 생존율을 검사한다. 세포 생존율은 각각의 농도별로 무처치 용매대조군에 대한 백분율(%)로 계산한다. 자외선 조사를 한 것과 하지 않은 것에서 얻어진 IC50 값(무처치 용매대조군과 비교하여 세포 생존율이 50%로 감소되는 농도)을 비교하여 광독성을 예측한다.

Ⅳ. 시험방법

가. 시험준비

1) 세포

9. 마우스 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 Balb/c 3T3 clone 31(ATCC 또는 ECACC)이 검증연구에 사용되었으므로 이 세포주의 사용을 권장한다. 다른 세포나 세포주를 사용할 수 있으나 본 시험에 사용하는 세포주와 동등함을 반드시 입증하여야 한다.

10. 세포의 마이코플라스마(mycoplasma) 오염을 정기적으로 검사하여 오염되지 않은 세포만 사용해야 한다(11).

11. 세포의 UVA에 대한 민감도는 계대수(passage number)와 관련되어 있으므로, 100미만의 최소 계대수의 세포를 사용하여야 한다.

2) 배지 및 배양 조건

12. Balb/c 3T3 세포의 경우 10% NBCS (new-born calf serum), 4 mM 글루타민, 페니실린(100 IU) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL) 등이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 배지로 사용하며 37℃, 완충액에 따라 5-7.5% CO2 조건에서 배양한다. 이 세포에 대해 이미 알려진 분열주기 범위 내에 있는지를 확인하여야 한다.

3) 배양 준비

13. 냉동 보관된 세포는 적절한 밀도로 배지에 분주하여 광독성시험을 하기 전에 적어도 한 번 계대배양을 한다.

14. 광독성시험을 위해 직접 사용할 세포는 적절한 밀도로 배지에 분주하여 시험 종료 시(세포배양 48시간 후 세포 생존율을 결정하는 시기)에도 세포가 플레이트 바닥 전체를 덮지 않도록 한다. 96-well 플레이트에서 배양하는 Balb/c 3T3 세포에 대해 권고하는 배양 밀도는 1 × 104 cells/well 이다.

15. 시험 물질 1개당 각각 2개의 96-well 플레이트에 동일한 조건으로 세포를 배양한다. 1개의 플레이트에는 UV를 조사하고(+Irr) 다른 1개는 UV를 조사하지 않으며(-Irr), 나머지 조작과정은 동시에, 동일하게 진행한다.

4) 시험물질 조제

16. 보관조건에서 그 안정성을 입증할 수 있는 자료가 없다면 시험물질은 사용 직전에 준비한다. 시험물질 취급과 처리는 시험물질이 광활성화되거나 분해되지 않는 조명 하에서 수행하도록 한다.

17. UV 조사 중 간섭을 피하기 위해 단백질 성분이나 광 흡수 성분(예: pH-지시약 , 비타민) 등이 없는 완충액[예: EBSS (Earle's Balanced Salt Solution)]에 시험물질을 녹인다. CO2 배양기 밖에서 50분간 세포에 UV를 조사하는 중에 알칼리화 되지 않도록 주의를 기울여야 한다. EBSS와 같은 약한 완충액을 사용할 경우 7.5% CO2 조건에서 배양하고, 강한 완충액을 사용하는 경우 5% CO2 조건에서 배양한다.

18. 물에 잘 녹지 않는 시험물질은 적절한 용매에 녹인다. 용매는 모든 농도의 시험군과 용매대조군에서 같은 용량이어야 하고, 그 농도에서 세포독성이 없어야 한다. 또한 시험물질의 농도는 침전물이 생기거나 혼탁해지지 않는 범위로 선택한다.

19. 용매로는 DMSO (dimethylsulphoxide)와 에탄올(EtOH)이 권장된다. 이외에 세포독성이 약한 다른 용매도 사용할 수 있다. 모든 용매에 대해서 시험물질과의 반응성, 광독성 효과의 방해, 라디칼 제거 특성, 용매 속에서의 화학적 안정성에 대한 특성이 검토되어야 한다.

20. 시험물질의 안정성에 영향을 주지 않는다면 용해에 도움이 되는 와류혼합(vortex mixing), 초음파 처리, 가온 등을 이용할 수 있다.

5) UV 조사조건

21. 광원 : 광독성시험에서 적절한 광원과 필터의 선택은 중요한 요소이다. 보통 in vivo에서는 UVA와 가시광선이 광독성 반응과 관련이 있으며(3)(12) UVB는 광독성 반응과는 관련이 적지만 세포독성이 매우 강하다. 파장이 313 nm에서 280 nm(13)로 바뀌면 세포독성은 1000배 증가한다. 적절한 광원에 대한 선택 기준은 시험물질이 흡수하는 파장대(흡수스펙트럼)의 빛을 방출해야 하며, 잘 알려진 광독성 물질들을 검출하기에 충분한 광량(합리적인 시간 내에 도달할 수 있는)이어야 한다. 또한 사용되는 파장과 광량이 시험계에 부적절한 영향(예: 적외선 영역에서의 열 방출)을 주어서는 안 된다.

22. 인공태양광조사기(solar simulator)가 적절한 인공광원으로 인정된다. 필터를 장착한 인공태양광조사기의 광도 분포는 한낮의 야외 광도 분포와 유사하여야 한다(14). 제논 아크(xenon arc)와 수은-할로겐 아크(mercury-metal halide arc)는 둘 다 인공태양광 조사장치로 사용된다(15). 후자는 열이 좀 덜 나고 값이 싼 장점이 있지만 제논 아크에 비해 태양광과의 유사도가 낮다. 모든 인공태양광 조사장치가 상당량의 UVB를 방출하기 때문에 세포독성이 매우 강한 UVB를 줄이기 위해서는 필터를 장착해야 한다. 세포 배양용 플라스틱 재료들이 UV 안정화제를 포함하기 때문에 시험분석 시 사용하는 것과 같은 96-well 플레이트 뚜껑을 통과하는 스펙트럼을 측정하여야 한다. 장착된 필터 또는 실험재료에 의해 여과된 스펙트럼 측정값은 표준화된 실외광을 벗어나지 말아야 한다(14). In vitro 3T3 NRU 광독성시험법 검증에 사용되었던 필터를 사용한 광조사기의 여과된 스펙트럼 분포도(8)(16)는 부록 3의 그림1과 같다.

23. 광량 측정 : 광세기는 적절한 UV 측정기를 사용하여 광독성시험 전에 정기적으로 점검하여야 한다. 광세기는 시험에 사용하는 것과 같은 96-well 플레이트 뚜껑을 통과하는 스펙트럼을 측정한다. UV 측정기는 광원에 대하여 보정해야 한다. UV 측정기의 정상 작동 여부를 점검하며, 이를 위해 제 2의 참조용(reference) UV 측정기로 같은 방법으로 보정하여 사용할 것을 권장한다. 이상적으로는 시간 간격을 두어 스펙트럼 측정기를 사용하여 여과된 광원의 스펙트럼별 광세기를 측정하고 UV 측정기를 보정하여야 한다.

24. UVA 영역에서 5 J/cm2의 광량은 Balb/c 3T3 세포에 대해 독성이 없으면서 화학물질을 활성화 시켜 광독성 반응을 일으키기에 충분한 것으로 밝혀졌다(6)(17). 예를 들어 본 연구에서 50분 내에 5 J/cm2에 도달하기 위한 광세기가 1.7 mW/cm2이었다(부록3 그림2). 만약 다른 세포주와 다른 광원을 사용하려면 세포에는 무해하면서 광독성 참고물질을 활성화 시키기에 충분한 광영역이 선택될 수 있도록 조사량을 보정한다. 이때 광 노출 시간은 다음과 같이 계산한다.

t(분) = [eqn: {광조사량( rm J/cm ^{2} ) TIMES 1000 it} over {광세기( rm mw/cm ^{2} ) TIMES 60` it} ```( rm 1J`=`1`Wsec)]

나. 시험조건

1) 시험물질 농도

25. UV 조사(+Irr) 및 UV 비조사(-Irr) 시 시험물질의 농도범위는 용량 범위 결정시험을 통해 결정한다. 화학물질의 용해도는 광 노출 시간 또는 노출 과정에 따라 변화할 수 있기 때문에 처음과 60분 후(또는 계획된 일정 처리 시간)에 용해도를 평가해 보는 것이 좋다. 또한 부적절한 배양조건, 강산성, 강알칼리성 화학물질에 의해 유도되는 독성을 피하기 위해 세포배양 시 pH는 6.5-7.8 범위 내에 있어야 한다.

26. 시험물질의 최고 농도는 삼투압이나 pH 스트레스가 가해지지 않는 생리적 허용 범위 내에 있어야 한다. 시험물질에 따라 최고농도를 제한하는 요소로서 다른 물리화학적 특성들이 고려될 수도 있다. 상대적으로 불용성이며 포화농도에서 무독성인 물질에 대해서는 도달할 수 있는 최대농도에서 시험되어야 한다. 또한 일반적으로 어떠한 시험농도에서도 시험물질이 침전되는 것은 피해야 한다. 시험물질의 최대농도는 1000 μg/mL 그리고 삼투압은 10 mmol을 초과해서는 안 된다. 일정한 희석비율로 8개의 시험물질 농도를 정한다.

27. UV 비조사 시에는 세포독성이 없지만 UV 조사 시 세포독성이 강하게 나타나는 시험물질에 대한 정보(농도범위 결정시험 등으로부터 얻어진)가 있다면 보다 유용한 시험결과를 얻기 위해 UV 조사 시의 농도범위를 UV 비조사 시의 농도범위와 다르게 할 수 있다.

2) 대조군(controls)

28. 세포의 광조사 민감도 및 축적데이터(historical data) 확립 : 시험에 사용하는 세포에 대해서는 UV 조사량에 따른 민감도를 정기적으로(약 5계대마다) 점검한다. 점검 시에는 3T3 NRU 광독성시험에서 사용되는 광량보다 높은 용량이 포함된 여러 광량이 사용되어야 한다. 이 광량은 UV 측정기로 쉽게 정량된다. 세포는 3T3 NRU 광독성시험에서 사용된 동일한 밀도로 배양한 후 다음날 UV로 조사한다. 1일 후 neutral red 흡수정도로 세포 생존율을 결정한다. 세포독성이 없는 최대 광량(예 : 검증시험 시 UVA 영역에서 5 J/cm2)은 표1의 참고물질들을 구별하는데 충분한 양이어야 한다.

29. 광조사 민감도, 시험의 점검 : 광조사 시 음성대조군 및 용매대조군의 세포 생존율은 비조사 시 세포 생존율의 80% 이상이어야 한다.

30. 용매대조군의 생존율 : 용매대조군에서 얻어진 neutral red의 절대 흡광도값(OD540 NRU)은 각 well에 분주된 1 × 104 세포가 2일간의 시험기간 동안 정상적으로 분열하면서 성장했음을 보여주는 지표이다. 용매대조군의 OD540 NRU은 ≥ 0.4 이어야 한다.

31. 양성대조군 : 매 시험마다 chlorpromazine (CPZ)같은 이미 알려진 광독성물질을 양성대조물질로 하여 동시에 시험해야 한다. CPZ를 이용하여 표준작업순서에 따라 시험하였을 경우 다음과 같은 시험결과가 얻어져야 한다. UV 조사조건에서 IC50 = 0.1-2.0 μg/mL, UV 비조사조건에서 IC50 = 7.0-90.0 μg/mL, PIF (photo irritation factor) > 6이어야 한다. 또한 양성대조군에 대한 시험결과를 지속적으로 모니터링 한다(시험물질의 종류나 용해도의 특성을 고려하여 CPZ 대신 다른 광독성물질도 양성대조물질로 사용할 수 있다).

다. 시험물질 및 대조물질의 적용(6)(7)(8)(16)(17)

1) 시험 1일 :

33. 배지 100 μL를 96-well 플레이트 외곽 well에 첨가하여 공시료(blank)를 만들고, 나머지 well에는 배지에 부유시킨 세포액(1 × 105 cells/mL) 100 μL를 첨가한다(=1 × 104 cells/well). 각 시험물질에 대해 2개(UV 조사 및 비조사)의 플레이트를 준비한다.

34. 플레이트를 24시간 배양하여 각 well 바닥면적의 반 정도가 단층배양세포로 충분히 채워지도록 한다.

2) 시험 2일 :

35. 배지를 버리고 완충액 150 μL로 조심스럽게 세척한다. 적절한 농도의 시험물질 또는 용매를 포함하는 완충액 100 μL를 각 well에 첨가하고 CO2 배양기에서 60분간 배양한다. 시험물질은 8가지 농도를 사용한다.

36. 각 시험물질 농도군 및 대조군별로 2개의 플레이트를 준비하고, 무작위로 선택하여 하나는 비조사시 세포독성을 결정하기 위한 용(예, 대조군 플레이트)으로 선택하고, 다른 하나는 조사시 광세포독성을 결정하기 위한 용(처리군 플레이트)으로 선택한다.

37. 배양 후 플레이트 하나는 어두운 곳에 50분 동안 방치하고, 다른 플레이트는 실온에서 50분 동안 UV를 조사한다. 플레이트 뚜껑을 덮은 채로 조사하며, 조사량은 세포독성이 없는 최대량으로 한다.

38. 시험물질 용액을 버리고 150 μL의 완충액으로 조심스럽게 두 번 세척한다. 배지를 첨가하고 하룻밤(18-22 시간) 동안 배양한다.

3) 시험 3일 :

- 현미경 관찰

39. 위상차 현미경을 사용하여 세포의 성장, 형태, 단층배양 정도를 조사하고 세포 형태 변화와 세포 성장에 대한 영향을 기록해 둔다.

- Neutral red 흡수 시험

40. 가온한 완충액 150 μL로 세포를 조심스럽게 세척하고, 세척액을 제거한 후, neutral red 배지(혈청을 함유하지 않은 배지에 neutral red를 50 μg/mL로 녹임) 100 μL를 첨가하여(16) CO2 배양기에서 3시간 동안 배양한다.

41. Neutral red 배지를 제거하고 완충액 150 μL로 세척한 후 완충액을 제거한다.

42. Neutral red 추출액 150 μL(물:에탄올:아세트산 = 49:50:1)를 각 well에 첨가한다.

43. 세포로부터 neutral red가 추출되어 균질한 용액이 형성될 때까지 마이크로타이터 플레이트 교반기(microtiter plate shaker) 위에서 10분 동안 천천히 교반시킨다.

44. 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 540 nm에서 neutral red 추출액의 흡광도를 측정한다(기준을 잡기 위해 공시료(blank)를 사용한다).

Ⅴ. 시험결과 및 보고

가. 시험자료

45. 시험자료는 광조사 유무 시 얻어지는 농도 반응을 분석하여 가능하면 시험물질의 IC50(세포 생존율이 50%로 감소되는 농도)값을 구한다. 만약 세포독성이 나타나면 농도 범위와 결과 값 모두 시험결과에서 얻어지는 곡선에 포함될 수 있도록 조정한다.

46. 1차 실험에서 명백한 양성 또는 음성 결과를 나타내는 경우 1회 이상 용량설정 예비시험으로 충분하다.

47. 모호하거나 불명확한 결과들은 추가 실험을 통해 명확히 한다. 이와 같은 경우 농도범위, 농도간격, 사전 배양시간, 광조사 시간 등의 실험조건 변경을 고려해 볼 수 있다. 물에 불안정한 화학물질의 경우 광조사 시간을 줄이는 것이 적절할 수 있다.

나. 시험결과 평가

48. PIF (photo irritation factor)값 또는 MPE (mean photo effect)값을 계산하여 시험결과를 평가한다.

49. 연속 용량 반응 곡선을 이용하여 비연속적인 용량 반응 값을 측정하고 광 세포독성 측정값을 구한다(18).

50. PIF값은 다음과 같은 수식을 이용하여 계산한다.

PIF=	IC50(-Irr, 비조사조건)
	IC50(+Irr, 조사조건)

광조사 유무로 IC50를 계산할 수 없다면, 시험물질에 대한 PIF값은 결정할 수 없다.

51. MPE값은 농도 반응 곡선의 차이를 기초로 하고 있다(19). MPE는 n개의 PE값 가중평균으로 정의된다.

MPE = [eqn: {sum _{rm i`=1 it} ^{rm n it} rm w _{i`} rm `PE _{c` _{rm `i}} it} over {sum _{rm i`=1 it} ^{rm n it} rm w _{i} it}]

- PEc = REc × DEc   : 농도 c에서의 PE (photo effect, 광효과)

- REc = Rc(-Irr)-Rc(+Irr)

: 농도 c에서의 RE (response effect, 반응효과)로 UV 조사 유무 시 관측되는 반응값의 차이

- DEc : 농도 c에서의 DE (Dose Effect, 용량효과)

DEc = [eqn: LEFT | {rm C/C ^{*} -1 it} over {rm C/C ^{*} +1 it} RIGHT |]

- C* (equivalence concentration)

: UV 조사(+Irr) 시 반응과 UV 비조사(-Irr) 시 반응이 같은 시험물질 농도

- wi (가중치 값) = MAX {Ri(+Irr), Ri(-Irr)}

: UV 조사 시(+Irr)와 UV 비조사(-Irr) 시 반응값의 최대값

DEc (용량효과)는 C (실제농도)와 C*가 비슷하면 0에 가까운 값이 되고 C*가 C (실제농도)보다 상대적으로 매우 크거나 작을 때는 1이 된다. UV 조사 시 반응값이 UV 비조사 시의 반응값보다 매우 크거나 작으면 용량효과는 1로 한다. MPE값이 0.15 (cut-off value) 보다 크면 광독성으로 분류한다.

52. PIF값 및 MPE값은 소프트웨어(Phototox 2.0, ZEBET at the BfR, Berlin Germany)를 사용하여 계산할 수 있다(20). (Source: http:/www.oecd.org)

다. 시험결과 해석

53. 시험결과의 해석은 표2와 같으며, PIF 값으로 5 초과 또는 MPE 값이 0.15 초과면 광독성 양성으로 판정한다(8).

판정	PIF값	MPE값
광독성 없음 (No phototoxicity)	PIF < 2	MPE < 0.1
광독성 가능성 있음 (Probable phototoxicity)	2 < PIF < 5	0.1 < MPE < 0.15
광독성 있음 (Phototoxicity)	PIF > 5	MPE > 0.15

54. 본 시험을 확립하기 위해서는 먼저 참고물질로 광독성을 평가하여 PIF나 MPE값이 표1에 언급된 값에 근접해야 한다.

표 1. 참고물질

화학물질명 (CAS 번호)	PIF	MPE	Absorption Peak	용 매 흡수 측정에 사용하는 용매임
Amiodarone HCL [19774-82-4]	> 3.25	0.27-0.54	242 nm 300 nm (shoulder)	ethanol
Chloropromazine HCL[69-09-0]	> 14.4	0.33-0.63	309 nm	ethanol
Norfloxacin [70458-96-7]	> 71.6	0.34-0.90	316 nm	acetonitrile
Anthracene [120-12-7]	> 18.5	0.19-0.81	356 nm	acetonitrile
Protoporphyrin IX, Disodium [50865-01-5]	> 45.3	0.54-0.74	402 nm	ethanol
L-Histidine [7006-35-1]	no PIF	0.05-0.10	211 nm	water
Hexachlorophene [70-30-4]	1.1-1.7	0.00-0.05	299 nm 317 nm (shoulder)	ethanol
Sodium lauryl sulfate [151-21-3]	1.0-1.9	0.00-0.05	no absorption	-

라. 시험자료 해석

55. 최고농도에서만 광독성이 나타나면(특히 화학물질이 수용성인 경우), 위험성 평가를 위해 피부 흡수 또는 축적자료 및 다른 시험자료(예: in vitro 동물피부나 인체피부, 피부모델 시험) 등을 고려할 필요가 있다.

56. 시험물질이 자외선 노출여부와 관계없이 독성이 나타나지 않고, 용해도가 낮아 농도설정이 어려운 경우 본 시험 적용보다는 다른 시험법을 고려해야 한다.

마. 시험보고서

57. 시험보고서에는 다음과 같은 정보를 포함하여야 한다.

1) 시험물질

- 시험물질의 판별자료(일반명, IUPAC, CAS 번호)

- 물리적 성상 및 순도

- 시험과 관련된 물리화학적 성상

- 자외/가시부 흡수스펙트럼(UV/vis absorption spectrum)

- 안정성, 광안정성(알고 있는 경우)

2) 용매

- 선택사유

- 용매에 대한 시험물질 용해도

- 시험배지에서 용매의 백분율

3) 세포

- 세포의 종류 및 근원

- 마이코플라스마 존재 여부

- 세포계대수(정확한 계대수를 알고 있는 경우)

- 세포의 광조사 민감도(In vitro 3T3 NRU 광독성시험에 사용한 인공태양광조사기로 측정)

4) 시험조건 1 : 시험물질 처리 전후의 배양조건

- 배지의 종류 및 조성

- 배양조건(CO2 농도, 온도, 습도)

- 배양기간(처리 전, 처리 후)

5) 시험조건 2 : 시험물질 처리조건

- 시험물질 농도 설정 근거(UV 조사 및 비조사시)

- 시험물질의 용해도 제한이 있는 경우와 세포독성이 없는 경우,  시험물질 최고농도에 대한 근거

- 시험물질 처리배지에 대한 종류 및 조성(완충액)

- 시험물질 처리기간

6) 시험조건 3 : 광조사

- 광원의 선택이유

- 광원과 인공태양광조사기의 제조사 및 종류

- 광원의 스펙트럼 특성

- 필터의 투과 및 흡수 특성

- 인공태양광조사기의 특성 및 보정

- 광원과 시험계간의 거리

- UVA 광세기: mW/cm2로 표시

- 자외선/가시광선 노출 기간

- UVA 광량: J/cm2로 표시

- 광조사 시 세포 배양 온도 및 어두운 곳에서의 세포배양 온도

7) 시험조건 4 : Neutral red 생존율 시험

- Neutral red 처리배지의 조성

- Neutral red 배양기간

- 배양조건(CO2 농도, 온도, 습도)

- Neutral red 추출 조건(추출액, 기간)

- Neutral red 광도를 읽는 분광광도기의 파장

- 이차파장(사용한 경우)

- 분광광도기 공시료(blank) 내용물(사용한 경우)

8) 결과

- 시험물질 각각의 농도와 용매대조군에서의 세포생존율(평균값으로 표시)

- 광조사 유무에 따른 농도 반응 곡선(시험물질 농도에 따른 상대 세포 생존율)

- 농도 반응 곡선 분석: 가능하면 IC50 계산[IC50(+Irr), IC50(-Irr)]

- PIF 또는 MPE의 계산을 이용하여 광조사 유무에 따른 두 농도 반응 곡선 비교

- 용매대조군의 시험 적용기준

- 절대생존율(광조사 유무에 따른 neutral red 흡광도)

- 음성대조군과 용매대조군의 기록(평균, 표준편차)

- 양성대조군의 시험 적용기준

- 양성대조군의 IC50(+Irr), IC50(-Irr), PIF/MPE

- 양성대조군의 기록: IC50(+Irr), IC50(-Irr), PIF/MPE, 평균, 표준편차

9) 결과 토의

10) 결론

Ⅵ. 참고문헌

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9. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA In vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, 305-327.

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17. ZEBET/ECVAM/COLIPA - Standard Operating Procedure: In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 1998. 18 pgs.

18. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W.,De Silva, O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708.

19. Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995)Mathematical modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127-138.

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21. http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349687_1_1_1_1,00.html

부록 1. 용어 정의

광세기(Irradiance) :  자외선 또는 가시광선이 표면에 작용하는 세기로 W/m2또는 mW/cm2으로 측정된다.

광량(Dose of light) : 자외선 또는 가시광선이 표면에 작용하는 양(광세기×시간)으로 표면적 당 Joule로 표시된다. (예: J/m2, J/cm2)

자외선 파장대(UV light wavebands) : CIE (commission internationale de L'Ecalairage) 권고에 따라 UVA (315-400nm), UVB (280-315nm), UVC (100-280nm)로 구분한다. UVA와 UVB를 320nm에서 구분하기도 하고 UVA를 340nm에서 UVA1과 UVA2로 나눌 수도 있다.

세포 생존율(Cell viability) : 세포 전체 활성을 측정하는 지표로서, 시험에 사용된 종말점과 시험설계에 따라 총세포수 및 세포 생명력과 관련이 있다(예: 세포 라이소좀으로 neutral red 염색액이 흡수되는 정도.

상대 세포 생존율 (Relative cell viability) : 용매대조군(또는 음성대조군)에 대한 세포 생존율을 표시하는 것으로 시험물질을 처리하지 않은 전체 시험과정(Irr +/-)을 거쳐서 나온 결과이다.

PIF (Photo-irritation-factor, 광자극지수) : 시험물질 처리 후 자외선 조사유무에 따른 IC50 값을 비교하여 생성된 지수

IC50 : 세포의 생존율이 50%로 감소되는 시험물질의 농도

MPE (Mean photo effect, 평균 광효과) : 시험물질 처리 후 자외선 조사유무에 따른 농도 반응 곡선을 수학적으로 계산하여 얻은 값

광독성(Phototoxicity) : 화학물질이 피부에 적용되거나 전신투여 된 후 피부가 빛에 노출되었을 때 나타나는 급성독성반응

부록 2. 화학물질 광독성시험의 흐름도

시험물질의 물리적, 화학적, 독성학적 평가

∙ 물리화학적 성상

∙ 화학구조, 구조적인 고려

∙ 자외/가시부(UV/vis) - 흡수

∙ QSAR - 광화학

∙ 일반독성(동태 및 대사 포함)

광독성시험 불필요

적절한 용매에서

자외/가시부(UV/vis) 흡수스펙트럼

(예 : 화장품원료기준 흡광도측정법, OECD TG101)

비흡수

흡수

In vitro 3T3 광독성시험 및/또는 필요시 다른 방법 병행

부록 3.

그림1. 광조사기의 스펙트럼 분포도

그림 1은 필터를 사용한 광조사기의 여과된 스펙트럼 분포도의 한 예이다. 이 그림은 in vitro 3T3 NRU 광독성시험법 검증을 위해 사용되었던 광조사기(doped metal halide source)로부터 얻은 결과이다. 2개의 다른 필터(H1 필터, H2 필터)와 플레이트 뚜껑을 닫았을 때의 추가 여과효과를 보여준다. H2 필터는 많은 양의 UVB에 견딜 수 있는 시험계(피부모델시험, RBC 용혈시험)에서만 사용되었고, 3T3 NRU 광독성시험에는 H1 필터가 사용되었다. 96-well 플레이트 뚜껑의 추가 여과기능이 UVB 범위에서 주로 관찰되며, amiodarone과 같은 화학물질이 여기 되기에 충분한 UVB가 여전히 남아있음을 보여준다.

그림 2. Balb/c 3T3 세포 광조사 민감도(UVA로 측정)

세포 생존율(%)

그림 2는 7개의 실험실에서 3T3 NRU 광독성시험법 검증을 위해 UVA 범위에서 측정된 세포에 대한 광조사 민감도이다. Open symbol로 표시된 2개의 곡선은 나이든 세포(계대가 많이 이루어진 세포)에서 얻어진 값으로, 새로운 세포주로 교체되어야 한다. Bold symbol로 표시된 곡선은 광조사 내성이 있는 세포를 나타낸다. 이 그림에서 세포독성이 없는 최고 조사량은 UVA 영역에서 5 J/cm2 (수직선)이며, 수평선은 UVA 영역에서 5 J/cm2로 조사했을 때의 시험 가능한 최소 세포 생존율을 나타내고 있다.

별첨 2. 원문(OECD TG 432)

“화장품 광독성 동물대체시험법(체외 3T3 NRU 시험법) 가이드라인(민원인 안내서) ”

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