등록번호

안내서-0866-01

화장품 단회투여독성 동물대체시험법

(고정용량법) 가이드라인

(민원인 안내서)

2018.  6. 26.

지침서ㆍ안내서 제ㆍ개정 점검표
명칭	화장품 단회투여독성 동물대체시험법(고정용량법) 가이드라인(민원인 안내서)
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상기 사항에 대하여 확인하였음.
2018년 6월 26일
			담당자 확 인(부서장)		고 경 육 박 기 숙

이 안내서는 화장품 단회투여독성 동물대체시험법(고정용량법) 가이드라인에 대하여 알기 쉽게 설명하거나 식품의약품안전처의 입장을 기술한 것입니다.

본 안내서는 대외적으로 법적 효력을 가지는 것이 아니므로 본문의 기술방식(‘∼하여야 한다’ 등)에도 불구하고 민원인 여러분께서 반드시 준수하셔야 하는 사항이 아님을 알려드립니다. 또한, 본 안내서는 2018년 6월 현재의 과학적ㆍ기술적 사실 및 유효한 법규를 토대로 작성되었으므로 이후 최신 개정 법규 내용 및 구체적인 사실관계 등에 따라 달리 적용될 수 있음을 알려드립니다.

※ “민원인 안내서”란 대내외적으로 법령 또는 고시ㆍ훈령ㆍ예규 등을 알기 쉽게 풀어서 설명하거나 특정한 사안에 대하여 식품의약품안전처의 입장을 기술하는 것(식품의약품안전처 지침서등의 관리에 관한 규정 제2조)

※ 본 안내서에 대한 의견이나 문의사항이 있을 경우 식품의약품안전평가원 독성평가연구부 특수독성과에 문의하시기 바랍니다.

전화번호: 043-719-5152, 5155

팩스번호: 043-719-5150

제·개정 이력

연번	제·개정번호	승인일자	주요내용
1	B1-2007-4-002	2008.11.	화장품 독성시험 동물대체시험법 가이드라인(II) 제정
2	안내서-0749-01	-	「식약처 지침서등의 관리에 관한 규정」 개정에 따른 일괄 재분류 (규제개혁담당관실-3761호, 2017.5.16)
3	안내서-0866-01	2018.06.	제목을 “ 화장품 단회투여독성 동물대체시험법(고정용량법) 가이드라인”으로 분리‧수정, 내용 정비 및 OECD 영문본을 추가하여 개정

Ⅰ. 개요	6

Ⅱ. 시험원리	6

Ⅲ. 제한점 및 고려사항	6

Ⅳ. 시험방법	7

Ⅴ. 시험결과 및 보고	8

- 별첨 1 : 번역본

- 별첨 2 : 원문

목  차

화장품 단회투여독성 동물대체시험법(고정용량법) 가이드라인

Ⅰ. 개요

본 시험법은 고정용량 투여를 기반으로 하는 단회투여독성시험법(고정용량법, Fixed Dose Procedure)으로, 시험 종료 시점을 동물 사망 여부로 평가하는 기존 방법 대신 고정용량 중 한 용량으로 투여 시 나타나는 명확한 독성 징후를 판단하여 시험물질의 GHS (Globally Harmonised System of classification and labelling of chemicals)  카테고리를 예측하는 방법이다.

예비시험은 본시험에서 치사량 이상의 용량투여를 피하기 위해 실시한다. 예비시험의 시작용량은 본 시험법에서 제시하는 고정용량 중에서 심각한 독성 영향이나 사망을 유발하지 않고, 일부 독성 징후를 발생시킬 것으로 예상되는 용량을 선택한다.

본시험에서는 예비시험에서 선정된 투여용량을 5마리의 동물(예비시험에 사용된 동물 1마리 포함)에 투여하여, 부록 3에서 제시하는 본시험 흐름도에 따라 최종적으로 시험물질을 GHS 카테고리로 분류한다.

Ⅱ. 시험원리

본 시험법은 각각 5, 50, 300, 2,000 mg/kg의 고정용량을 단계별로 동물에게 경구투여 하여 독성 증상이나 사망의 유무에 따라 다음 단계의 방법을 결정한다. 다음 단계에서는 더 높은 용량 또는 더 낮은 용량을 선택하여 추가적으로 투여한다.

Ⅲ. 제한점 및 고려사항

본 시험법에서는 적정의 독성용량만을 사용하며, 치사량 이상 또는 부식성이나 심각한 자극성 때문에 과도한 통증과 고통을 유발하는 용량은 투여할 필요가 없다. 한계시험은 해당 시험물질이 규제 한계용량 이상에서만 독성을 나타낸다는 증거가 있는 경우에 적용하며, 특정한 규제적 필요성에 의해 타당성이 입증된 경우에만 추가적으로 5,000 mg/kg의 고정용량을 고려할 수 있다.

시험에 앞서 시험물질 기본 정보와 화학적 구조, 그의 물리화학적 특성, 다른 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro) 독성 시험 결과 등에 관한 정보를 파악한다. 독성정보가 알려지지 않는 경우, 알려진 성분과 비율을 고려하여 유사한 화합물이나 혼합물 또는 제품의 시험결과에서 시험물질의 독성정보를 확보한다.

Ⅳ. 시험방법

4.1. 시험 준비

일반적으로 시험동물은 암컷 랫드를 사용하고, 수컷을 사용할 경우에는 그 타당성을 제시해야 한다. 시험동물은 투여 최소 5일전에 사육실에 반입하여 순화시킨 다음, 무작위로 선정하여 식별표시를 한다. 동물의 적정 연령, 사육 및 식이조건은 별첨 1의 Ⅳ-가항을 참조한다.

투여할 시험물질을 조제할 때 우선적으로 물을 사용한 용액/현탁액/유화액, 그 다음으로 옥수수기름(corn oil)을 사용한 용액/현탁액/유화액이 권장되며 그 외에 다른 용매로 용액을 조제할 수 있다. 물 이외의 다른 용매를 사용하는 경우에는 그의 독성학적 특성을 알아야 한다. 시험기간 동안 조제물의 안정성이 확보되지 않는 경우 투여직전에 물질을 조제한다.

4.2. 투여

시험물질을 한 번에 투여할 수 있는 최대 액량은 설치류의 경우 1 mL/100 g (체중)을 넘지 않아야 한다. 하지만 수용액인 경우에는 2 mL/100 g 까지도 고려할 수 있다. 시험물질은 위관이나 적당한 삽관 캐뉼라를 사용하여 단일용량을 경구투여(gavage)하며, 한 번에 투여하는 것이 곤란한 시험물질은 24시간 이내에 분할 투여할 수 있다.

4.3. 예비시험

예비시험은 본시험의 적정 시작용량을 선택하는데 목적이 있다. 예비시험의 시작용량은 기존 실험 데이터를 근거로, 명백한 독성을 유발할 것으로 예상되는 고정용량(5, 50, 300, 2,000 mg/kg) 가운데 하나를 선택한다. 이러한 정보가 없을 때는 시작용량을 300 mg/kg으로 선정한다.

최저 고정용량(5 mg/kg)을 투여한 동물이 사망할 경우 예비시험을 중단하고 이 물질을 GHS 카테고리 1로 분류한다(부록 2 참조). 이 분류를 추가로 확인할 필요가 있으면 선택적으로 추가시험을 실시한다. 두 번째 동물에 5 mg/kg을 투여하여 두 번째 동물이 사망하면 GHS 카테고리 1로 판정하고 시험을 중단한다. 만약 두 번째 동물이 생존하면 1마리씩 최대 3마리에게 5 mg/kg을 추가로 투여한다. 그 결과 2마리 이상의 사망이 발생한 경우 부록 3(본시험)의 5 mg/kg 고정용량에서의 분류 규칙에 따라 GHS 카테고리 1로 분류하고, 1마리 이하 사망 시 카테고리 2로 분류한다.

4.4. 본시험

예비시험에서 선정된 용량을 시작용량으로 하고, 시험동물은 예비시험에서 투여된 1마리와 본시험에서 추가된 4마리를 포함하여 총 5마리를 사용한다. 단, 예비시험에서의 투여용량이 본시험과 다른 경우는 제외한다. 각 용량의 투여 시간 간격은 독성 증상의 발생, 지속시간 및 심한정도에 따라 결정한다. 이전 투여 동물의 생존여부를 확신할 때까지 3~4일의 투여간격을 두는 것이 좋으며 그 이후에 다음 단계의 투여를 진행한다.

한계시험은 시험물질이 비독성일 가능성이 높은 시험물질인 경우에 실시하며, 2,000 mg/kg(예외적으로 5,000 mg/kg) 용량에서 예비시험을 실시하고 이 용량을 추가로 4마리에게 투여한다.

4.5. 관찰 및 판정

투여 후 30분 동안은 최소 1회 관찰한다. 이후 첫 24시간 동안 주기적으로 관찰하며, 14일 동안 동물의 체중 변화, 독성증상, 지속시간, 심한정도 등을 매일 관찰하고 기록해야 한다. 이 과정에서 특히 첫 4시간 동안 주의를 기울인다.

시험 도중에 사망한 동물(동물복지 차원에서 시험도중에 안락사 시킨 동물 포함)과 생존한 모든 동물은 부검을 실시하며,  24시간 이상 생존한 동물에서 이상소견을 보이는 장기는 조직병리학적 검사를 실시한다.

부록 3에 제시된 흐름도와 같이 시험동물이 2마리 이상 사망한 경우 A로 판정하고, 명백한 독성 증상이 1마리 이상에서 보일 때는 B로 판정하며, 아무런 독성증상이 없을 때는 C로 판정한다.

Ⅴ. 시험결과 및 보고

동물별로 모든 데이터를 도표 형식으로 정리하여 제시한다. 데이터에는 시험 그룹별로 전체 동물의 수, 독성 증상을 보인 동물의 수, 시험 도중에 사망한 동물이나 인도적으로 안락사 시킨 동물의 수, 동물별 사망 시점, 독성 영향에 대한 설명 및 부검 결과를 기술한다.

별첨 1. 번역본(OECD TG 420)

단회투여독성시험법(고정용량법)

Acute Oral Toxity-Fixed Dose Procedure

Ⅰ. 서론

1. OECD 가이드라인은 과학적 진보 또는 평가 방법의 변화를 고려하여 주기적으로 검토된다. 최초 가이드라인 402은 1992년 7월, 시험 지침 401에 기술된 기존의 급성 독성 시험의 첫 번째 대안으로 채택되었다. 여러 전문가 회의의 권고에 따라 개정은 다음과 같은 이유로 적합하게 고려되었다. ⅰ) 1992년 가이드라인에서 권고된 cut-off와 다른 화학물질 분류에 대한 LD50 cut-off 값이 국제적으로 합의되었다. ⅱ) 한쪽 성별(주로 암컷)의 시험은 현재 충분히 고려되었다.

2. 단회투여 독성을 평가하는 종래의 방법은 동물 사망을 시험 종료 시점으로 한다. 1984년 BTS(British Toxicology Society)는 고정용량 투여를 기반으로 하는 단회투여독성시험을 제안했다(1). 이 방식은 시험 종료 시점을 동물 사망여부로 하는 대신 고정용량 중 한 용량으로 투여 시 명확한 독성 증상이 나타나는지 여부로 한 것이다. 영국(2) 및 국제적(3) 생체내(in vivo) 검증 연구에 근거하여, 위원회는 1992년에 이 시험방법을 시험 가이드라인으로 채택했다. 이후 일련의 연구를 거쳐 수학적 모델을 이용한 일련의 연구에서 고정용량 방법의 통계학적 특징이 평가되었다(4)(5)(6). 생체내(in vivo) 실험과 모델링 연구를 통해, 이 시험법이 재현성이 있으며 종래의 시험방법보다 적은 동물을 사용하고 고통을 덜 유발하며, 다른 급성 독성 시험방법과 유사한 방식으로 성분의 등급을 정할 수 있는 것으로 밝혀졌다(시험 지침 423, 425).

3. 시험 목적에 가장 적합한 시험방법의 선택에 대한 지침은 단회투여독성시험 지침서(7)에 기재되어 있다. 또한 지침서 420의 수행 및 해석에 대한 추가 정보도 포함되어 있다.

4. 이 가이드라인에서 사용하는 용어의 정의는 부록 1과 같다.

Ⅱ. 초기 고려사항

5. 본 시험에서는 적정의 독성용량만을 사용하며, 치사량 이상의 용량 투여는 피하는 것이 이 방법의 원칙이다. 또한 부식성 또는 심각한 자극성 때문에 명확한 통증과 고통을 유발하는 것으로 알려진 용량은 투여할 필요가 없다. 사망 직전의 동물이나 뚜렷한 통증 상태 또는 중증의 지속적 고통 징후를 보이는 동물은 인도적으로 안락사 시키고, 시험 도중에 죽은 동물과 동일한 방식으로 시험 결과의 해석 시에 검토한다.

6. 이 시험법은 위해 특징에 관한 정보를 제공하며, 급성 독성을 유발하는 화학물질의 분류에 관한 시스템(GHS)에 의거하여 그 결과를 바탕으로 특정 성분의 등급을 정하고 분류할 수 있다(8).

7. 시험 시작에 앞서 시험 물질에 관한 모든 가용 정보를 검토한다. 시험물질의 기본 정보와 화학적 구조, 그의 물리적/화학적 특징, 다른 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 독성 시험 결과, 구조적 연관성이 있는 성분의 독성 데이터, 그리고 그 성분의 예상용도 등에 관한 정보가 이에 해당된다. 이런 정보는 인간의 건강 보호와 이 시험의 연관성을 결정하는데 유용하며, 적절한 시작용량을 선정하는데 도움이 될 수 있다.

Ⅲ. 시험원리

8. 5, 50, 300, 2,000 mg/kg의 고정용량을 단계별로 한쪽 성별의 동물그룹에 투여한다(예외적으로 5,000 mg/kg의 추가적인 고정 용량을 고려할 수 있다(단락 19 참고). 심각한 독성 영향이나 사망을 유발하지 않고 일부 독성 증상을 발생시킬 것으로 예상되는 용량으로 실시한 연구 결과에 근거하여, 시작용량을 선정한다. 독성 증상이나 사망의 유무에 따라 더 높거나 낮은 고정용량을 추가 동물에게 투여할 수 있다. 명백한 독성을 유발하는 용량이나 한 마리 이상의 사망을 유발하지 않는 용량이 확인될 때까지, 또는 최고용량에서 아무런 영향이 관찰되지 않거나 최저용량에서 사망이 발생할 때까지, 이 절차를 반복한다.

Ⅳ. 시험방법

가. 준비

1) 동물종의 선정

9. 다른 설치류를 사용할 수도 있지만, 가장 바람직한 것은 랫드이다. 일반적으로 암컷 랫드를 사용한다(7). 기존 LD50 시험에 관한 문헌을 조사한 결과, 일반적으로 성별 사이의 감수성 차이가 별로 없으며, 차이가 있더라도 암컷이 약간 더 민감한 것으로 나타났기 때문이다(9). 하지만 구조와 연관된 독성 또는 독성동태학적 특징을 알고 있으며 이에 따르면 수컷이 더 민감한 경우에는 수컷을 사용한다. 수컷을 상대로 시험을 실시한다면, 그 타당성을 제시해야 한다.

10. 일반적으로 실험실에서 사용하는 동물 종은 건강하고 젊은 성체를 사용한다. 암컷은 새끼를 낳은 적이 없고 새끼를 배지 않은 상태여야 한다. 투여 시작 시점의 동물 연령은 8주에서 12주 사이여야 하며, 몸무게는 앞서 투여한 동물의 체중 평균 대비 ± 20% 구간에 속해야 한다.

2) 사육 및 식이조건

11. 시험동물 사육실의 온도는 22℃(± 3℃)를 유지하여야 한다. 상대 습도는 최소한 30%로 하고 실내 청소 기간 이외에는 70%를 넘지 않도록 하는 것이 바람직하며, 50~60%를 목표로 한다. 인공조명을 사용하며, 12시간 간격으로 명암 주기를 조정한다. 일반적인 설치류 사료를 사용하며 음용수를 적절히 공급한다. 동물을 용량별로 그룹을 지어 케이지에 넣고, 케이지 별 동물의 수는 각 동물을 명확히 관찰하는데 방해가 되지 않아야 한다.

3) 동물 준비

12. 시험 조건에 순응할 수 있도록, 적어도 투여 5일 전에 동물을 무작위로 선정하고 개별적으로 식별 표시를 하며 각자의 케이지에 넣는다.

4) 시험물질 준비

13. 일반적으로 시험물질은 농도를 달리하여 시험할 용량 범위로 일정량을 만들어 투여한다. 액상 물질이나 혼합물을 시험한다면, 일정 농도의 미희석 시험물질을 사용하는 것이 그 성분의 위해 평가에 보다 관련성이 있을 것이며, 어떤 경우이건 최대 투여액량을 넘지 않도록 한다. 한 번에 투여할 수 있는 최대액량은 시험동물의 크기에 따라 다르다. 설치류의 경우에는 체중 100 g 당 1 mL을 넘지 않아야 한다. 하지만 수용액인 경우에는 2 mL/100 g 까지도 고려할 수 있다. 시험물질을 조제할 때 물을 사용하여 용액/현탁액/유화액을 조제하며, 그다음으로는 옥수수기름(corn oil)을 사용하여 조제한 액상/현탁액/유화액을 권장한다. 그 외에 다른 용매를 사용한 용액을 사용할 수 있으며, 물 이외의 다른 용매를 사용하는 경우에는 그의 독성학적 특성을 알아야 한다. 사용 기간까지의 안정성이 확보되지 않았다면, 투여 직전에 조제한다.

Ⅴ. 시험절차

가. 투여

14. 시험물질은 위관이나 적합한 삽관 캐뉼라를 사용하여 단일 용량을 경구투여(gavage) 한다. 또한, 한 번에 투여하는 것이 곤란한 시험물질에 대해서는 24시간 이내에 분할 투여할 수도 있다. 다만, 분할하여 투여한 경우는 그 이유를 명확히 하는 것이 필요하다.

15. 투여에 앞서 동물을 절식시킨다(예, 랫드의 경우에는 하룻밤 동안, 마우스인 경우에는 3~4시간 동안 사료를 공급하지 않고 음용수만 제공한다). 절식 기간이 지난 다음에 체중을 측정하고 시험물질을 투여한다. 물질 투여 이후에는 랫드의 경우에 3~4시간, 마우스는 1~2시간 동안 추가로 사료를 주지 않을 수 있다. 일정 기간 동안 나누어 투여하는 경우에는, 기간에 따라 사료와 음용수를 동물에게 공급할 필요가 있을 수 있다.

나. 예비시험

16. 예비시험의 목적은 본시험의 적정 시작용량을 선택하는데 있다. 시험물질을 부록 2의 흐름도에 따라 순차적으로 동물에 투여한다. 본시험을 위한 시작용량을 결정할 수 있을 때(또는 최저 고정용량에서 사망이 관찰된 경우), 예비실험을 완료한다.

17. 예비시험의 시작용량은 동일 화학물질과 구조적으로 연관성이 있는 화학물질의 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro) 실험 데이터를 근거로, 명백한 독성을 유발할 것으로 예상되는 용량으로써, 5, 50, 300, 2,000 mg/kg의 고정용량 중에서 선택한다. 이런 정보가 없을 때는 시작용량을 300 mg/kg으로 한다.

18. 각 동물의 투여 간격을 최소 24시간으로 한다. 모든 동물을 최소 14일간 관찰한다.

19. 예외적으로, 특정한 규제적 필요성에 의해 타당성이 입증된 경우에만, 추가적으로 5,000 mg/kg의 고정용량을 고려할 수 있다(부록 4 참조). 동물 복지 차원에서 GHS 카테고리 5 범위(2,000~5,000 mg/kg)에서 시험을 실시하는 것은 권장되지 않으며, 시험 결과가 사람이나 동물의 건강 또는 환경 보호 측면과 직접적인 연관성을 가질 가능성이 높은 경우에만 이 방법을 검토한다.

20. 예비시험에서 최저 고정용량(5 mg/kg)을 투여한 동물이 사망하면 예비시험을 중단하고, 이 성분을 GHS 카테고리 1로 분류한다(부록 2 참조). 하지만 이 분류를 추가로 확인할 필요가 있으면, 선택적인 보완 시험을 다음과 같이 실시할 수 있다. 두 번째 동물에 5 mg/kg을 투여한다. 이 두 번째 동물이 사망하면 GHS 카테고리 1으로 확인되는 것이며, 이 시험은 즉시 종료한다. 두 번째 동물이 생존하면 최대 3마리에게 5 mg/kg을 추가로 투여한다. 사망 위험성이 높기 때문에, 이들 동물은 동물 복지 차원에서 순차적으로 투여한다. 각 동물의 투여간격은 이전 동물이 생존할 가능성이 있다고 판단하기에 충분해야 한다. 두 번째 동물이 사망하면, 투여를 즉시 중단한다. 두 번째 동물의 사망(종료 당시에 시험한 동물의 수와 관계없이)은 A 결과에 해당되므로(2마리 이상의 사망), 부록 3의 5 mg/kg 고정용량에서의 분류 규칙을 따른다(2마리 이상이 사망하면 카테고리 1, 1마리 이상 사망하지 않으면 카테고리 2).

다. 본시험

1) 동물의 수와 용량

21. 시작용량에서 시험 이후에 취할 조치사항이 부록 3에 화살표로 표시되어 있다. 3개의 조치사항 가운데 하나가 요구된다. 실험을 중지하고 적절한 위해 분류 클래스를 부여하거나, 더 높은 고정용량에서 시험을 하거나, 더 낮은 고정용량에서 시험을 실시한다. 하지만 동물 보호를 위하여 예비시험에서 사망을 유발한 용량은 본시험에서 다시 실험하지 않는다(부록 3 참조). 경험에 의하면, 시작용량에서 그 물질을 분류하고 추가 시험이 필요하지 않을 가능성이 높다.

22. 한쪽 성별당 총 5마리를 조사된 각 용량별로 사용한다. 5마리는 예비시험에서 선택한 용량을 투여한 1마리와 추가 4마리로 구성한다(본시험의 용량이 예비시험에 포함되지 않은 경우는 예외).

23. 각 용량에서 투여 시간 간격은 독성 증상의 발생, 지속 기간, 심한정도에 따라 결정한다. 이전 투여 동물의 생존을 확신할 때까지, 다음 단계 용량의 동물 투여를 연기한다. 필요한 경우에는 지연 독성 관찰을 위해, 각 용량에서 투여 사이에 3일 또는 4일의 간격을 두는 것이 좋다. 반응이 확실하지 않은 경우 등, 필요에 따라 간격을 조정할 수 있다.

24. 5,000 mg/kg의 상한 고정용량을 검토할 때는, 부록 4에 제시된 절차를 따른다(5. 시험절차 나. 예비시험 참조).

2) 한계시험

25. 한계시험은 해당 시험물질이 비독성일 가능성이 있다는 정보, 즉 규제 한계용량 이상에서만 독성을 나타낸다는 증거가 있는 경우에 적용한다. 시험물질의 독성 정보는 독성학적 의미가 있는 것으로 알려진 성분과 그의 비율을 고려하여, 유사한 화합물이나 혼합물 또는 제품의 시험 결과에서 확보할 수 있다. 독성 정보가 거의 없거나 시험물질이 독성을 가질 것으로 예상되는 경우에는 본시험을 실시한다.

26. 2,000 mg/kg(또는 예외적으로 5,000 mg/kg) 용량 수준에서 예비시험을 실시하고, 이 수준의 용량을 추가로 4마리에 투여한다.

라. 관찰

27. 투여 동물을 개별적으로 관찰하며, 투여 이후 30분 동안 최소 1회 관찰하고 이후 첫 24시간 동안 주기적으로 관찰하며(특히 첫 4시간 동안 주의하여 관찰), 이후에는 동물 복지 차원에서 안락사 시켰거나, 시험에서 제외된 동물을 제외하고는 14일 동안 매일 관찰한다. 하지만 관찰 기간을 엄격하게 고정시킬 필요는 없다. 독성 반응과 시험 시작시기, 그리고 회복 기간을 감안해 결정하며 필요한 경우에는 늘어날 수도 있다. 독성 징후가 나타나고 사라지는 시기가 중요하다. 독성 징후가 지연되어 나타나는 경향이 있을 때 특히 그렇다(10). 모든 관찰 내용을 동물별 기록서에 체계적으로 기록한다.

28. 동물이 계속 독성 증상을 보이면, 추가 관찰이 필요하다. 이때 피부와 털, 눈, 점막, 그리고 호흡기, 자율신경계와 중추신경계, 그리고 체성 운동 활동과 행동 패턴의 변화를 관찰한다. 진전, 경련, 타액 분비, 설사, 무기력, 수면, 혼수상태의 관찰에 주의를 기울인다. 사망 직전 상태인 동물과 심각한 통증이나 심각한 고통 징후를 보이는 동물은 인도적으로 안락사 시킨다. 동물을 인도적으로 안락사 시키거나 동물이 사망한 상태로 발견되면, 사망 시점을 최대한 정확하게 기록한다.

마. 체중

29. 시험물질을 투여하기 직전, 투여 후에는 적어도 매주 동물의 체중을 잰다. 체중 변화를 계산하고 기록한다. 체중 측정의 빈도는 그 추이를 알도록 하는 것이 원칙이므로 모든 예에 획일적으로 규정할 필요는 없다. 시험 종료 시에 생존 동물의 체중을 재고 인도적으로 안락사 시킨다.

바. 병리

30. 시험한 모든 동물(시험 도중에 사망한 동물이나 동물 복지 차원에서 시험 도중에 안락사 시킨 동물 포함)을 부검한다. 동물별로 모든 병리학적 변화를 기록한다. 24기간 이상 생존한 동물에서 이상소견을 보인 장기는 조직병리학적 검사를 실시하여 유용한 정보를 얻도록 한다.

Ⅶ. 결과 및 보고

가. 데이터

31. 동물별로 데이터를 제시한다. 또한 모든 데이터를 도표 형식으로 정리하여, 시험 그룹별로 전체 동물의 수, 독성 증상을 보인 동물의 수, 시험 도중에 사망한 동물이나 인도적으로 안락사 시킨 동물의 수, 동물별 사망 시점, 독성 영향에 대한 설명과 경과, 그리고 회복성, 부검 결과를 기술한다.

나. 결과 보고

32. 시험보고서에는 다음과 같은 정보를 포함하여야 한다.

1) 시험물질

- 물리적 특성, 순도, 그리고 관련성이 있는 경우에는 이화학적 특징

(이성질체 포함)

- 기본 식별 정보(CAS 번호 포함)

2) 용매

- 물 이외의 용매를 사용하는 경우에는 그 용매 선택의 이유

3) 시험동물

- 종/계통

- 알고 있는 경우에는 동물의 미생물학적 상태

- 동물의 수, 연령, 성별(암컷 대신에 수컷을 사용한 경우 그 이유)

- 출처, 사육 조건, 사료 등

4) 시험조건

- 시험물질의 물리적 상태에 대한 설명, 시험물질의 조성에 대한 설명

- 투여량과 투여시기를 포함하여 시험물질의 투여에 관한 정보

- 사료와 음용수의 품질(사료 종류/출처, 음용수 출처 포함)

- 시작용량 선정 근거

5) 결과

- 동물별 반응 데이터와 용량 수준의 도표화(즉, 사망을 포함하여 독성 징후를 보인 동물과

독성 증상의 특성, 심한정도, 지속 기간)

- 체중과 체중 변화

- 투여 당일의 동물 체중과 이후 주간 간격과 사망 또는 인도적 안락사 당시의 체중

- 시험 도중 사망한 경우에는 그 일시

- 독성 증상 발현 시간과 동물별로 독성 증상의 회복성 여부

- 동물별 부검 결과와 가능한 경우에는 조직 병리학적 검사 결과

6) 고찰과 결과의 해석

7) 결론

Ⅶ. 참고문헌

1. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

2. Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol." 6, 279-291.

3. Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling,  D. TomLinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose  procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

4. Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

5. Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323.

6. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2000). Statistical evaluation of  modifications to the fixed dose procedure (manuscript in preparation).

7. OECD (2000). Guidance Document on Acute Oral Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No.24.

8. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Chemicals  Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation.        Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19.

9. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and        Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of  the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998,     Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/ 0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.htmL].

10. Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I.,   Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the        Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

11. Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation In:      Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

부록 1. 용어정의

급성 경구 독성(Acute oral toxicity) : 어떤 성분의 단일 용량 경구 투여 이후 또는 24시간 이내에 여러 용량을 투여한 이후에 나타나는 이상 반응을 의미

지연 사망(Delayed death) : 동물이 48시간 이내에 사망하지 않거나 사망 직전으로 보이지 않았지만, 그 후 14일 관찰기간 동안 사망하는 것을 의미

투여 용량(Dose) : 투여한 시험물질의 양을 의미한다. 용량은 시험동물의 단위 체중 당 시험 성분의 중량(예, mg/kg)으로 나타낸다.

명백한 독성증상(Evident toxicity) : 시험물질을 투여한 후 나타나는 뚜렷한 독성증상을 나타나는 것을 일컫음(Van den Heuvel, M.J., Clark, D. G., Fielder, R. J., P.P., Oliver, G.J. A., Pelling, D., Tomlinso, N.J. and Walker, A. P.(1990). 분류학적 LD50 시험을 대체하기 위한 방법에 대한 고정용량법의 국제 검증. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.(3)참조). 가장 높은 고정용량에서의 심한 스트레스의 지속적인 사인이나 심한 고통, 빈사사상태(인도적 종료시점 지침문서(Humane Endpoints Guidance Documents)(8)에서 제시하는 기준) 또는 대부분의 동물에서 발생할 수 있는 치사

화학물질에 대한 분류·표시 국제조화시스템(Globally Harmonised Classification System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) : OECD(사람 건강 및 환경), UN 위험 물품 운송에 관한 전문가 위원회(이화학적 특징), ILO(위험 요소 정보 교환)이 공동을 추진하는 프로그램으로, IOMC (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals)이 업무를 조정한다.

임박한 죽음(Impending death): 다음 관찰시간 이전에 빈사상태 또는 사망이 예상될 때를 말함. 설치류에서 이러한 상태를 나타내는 증상은 경련, 옆으로 누운 자세, 누움, 발작 등이다. (자세한 내용은 인도적 종료시점 지침문서(Humane Endpoints Guidance Documents)(8) 참조).

LD50 : 경구 투여 시에 50%의 동물에서 사망을 유발할 것으로 예상되는, 통계적으로 도출한 단일용량을 의미한다. LD50은 시험동물의 단위 체중 당 시험 성분의 중량(mg/kg)으로 나타낸다.

한계 용량(Limit dose) : 시험 시의 상한 한계에 해당되는 용량을 의미한다(2,000 또는 5,000 mg/kg).

빈사상태(Moribund status): 생존가망이 없거나 죽어가는 상태(자세한 내용은 인도적 종료시점  지침문서(8) 참조).

예견된 죽음(Predictable death): 계획한 시험 종료시점 이전에 사망을 예측할 수 있는 임상징후가 나타나는 경우. 예: 사료나 물에 접근 불가(자세한 내용은 인도적 종료시점 지침문서(8) 참조).

부록 2. 예비시험 흐름도

부록 3. 본시험 흐름도

부록 4.

시험을 수행하지 않고 LD50가 2,000 mg/kg을 초과할 것으로 예상되는 시험물질의 분류 기준

1. 위험 요소 카테고리 5의 기준은 급성 독성 위험이 상대적으로 낮지만 특정 상황에서는 취약 집단에 위험이 될 수 있는 시험물질의 파악을 위한 것이다. 이들 성분은         2,000~5,000 mg/kg 범위에서 경구 또는 피부 LD50를 가질 것으로 예상되며, 다른 경로에서는 이에 상응하는 값을 가질 것으로 예상된다. 시험물질은 다음의 경우에 2,000 mg/kg <  LD50 < 5,000mg/kg (카테고리 5, GHS)으로 정의되는 위험 요소 카테고리로 분류될 수 있다.

가.	사망률에 근거하여 부록 3의 흐름도에 따라 이 카테고리로 정해지는 경우.

나.	LD50가 카테고리 5의 범위일 것이라는 믿을 수 있는 증거가 이미 있거나 다른 동물시험이나 사람에서의 독성 영향에 따라 급성으로 인간의 건강에 문제가 될 우려가 있는 경우.

다.	데이터의 외삽, 추정, 측정을 통해 보다 위험한 카테고리로의 분류가 필요하지 않다고 판단되며

∙	인간에서의 유의미한 독성 영향을 보여 주는 신뢰성 있는 정보가 있거나

∙	경구 경로로 카테고리 4 값까지 시험했을 때 사망이 관찰되거나

∙ 설사, 모기립 (piloerection), 또는 털을 고르지 못하는 상태(ungroomed appearance)을 제외하고, 최대 카테고리 4값까지 시험했을 때, 유의미한 임상적 독성 징후가 있다고 전문가가 판단하거나

∙	다른 동물 시험 결과를 통해 유의미한 급성 영향 가능성을 보여 주는 신뢰성 있는 정보를 전문가가 확인한 경우.

2,000 mg/kg 이상 용량에서의 시험

2. 예외적으로, 그리고 규제 필요성의 타당성이 입증된 경우에만, 추가적으로 5,000 mg/kg 의 고정용량을 고려할 수 있다. 동물복지 차원에서 5,000 mg/kg에서 동물 시험을 실시하는 것은 권장되지 않으며, 이 시험 결과가 인간이나 동물의 건강 보호 측면과 직접적인 연관성을 가질 가능성이 높은 경우에만 이 방법을 검토한다(8).

가. 예비시험

3. 부록 2에 제시된 순차적 절차에 적용되는 의사 결정 규칙을 확대하여 5,000 mg/kg 용량까지 포함한다. 그러므로 예비시험에서 5,000 mg/kg을 시작용량으로 하고 A 결과(사망)가 발생하면, 두 번째 동물을 2,000 mg/kg에서 시험한다. B와 C 결과(명백한 독성이나 무  독성)가 나타나면, 본시험 시작용량으로 5,000 mg/kg으로 정한다. 마찬가지로 5,000 mg/kg 이외의 용량을 시작용량을 정한다면, 2,000 mg/kg에서 B나 C 결과가 나오더라도 5,000 mg/kg까지 진행한다. 이후 5,000 mg/kg에서 A 결과가 나오면, 본시험의 시작용량을 2,000 mg/kg으로 하고, B와 C 결과가 나오면 본시험의 시작용량을 5,000 mg/kg으로 한다.

나. 본시험

4.. 부록 3에 제시된 순차적 절차에 적용되는 의사 결정 규칙을 확대하여 5,000 mg/kg 용량까지 포함한다. 그러므로 본시험에서 5,000 mg/kg을 시작용량으로 하고 A 결과(사망 2건)가 발생하면, 두 번째 그룹을 2,000 mg/kg에서 테스트한다. B 결과(명백한 독성 및/또는 사망 1건)와 C 결과(무독성)가 나타나면, GHS에 따라 그 성분은 미분류(unclassified)가 된다.

마찬가지로 5,000 mg/kg 이외의 시작용량을 정한다면, 2,000 mg/kg에서 C 결과가 나오더라도 5,000 mg/kg까지 진행한다. 이후 5,000 mg/kg에서 A 결과가 나오면 그 성분을 GHS  카테고리 5로 분류하고, B나 C 결과가 나오면 미분류로 한다.

별첨 2. 원문(OECD TG 420)

“화장품 단회투여독성 동물대체시험법(고정용량법)

가이드라인(민원인 안내서)”

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